2021年综述：NK细胞的发育、受体和功能

　　和其他固有免疫细胞不同的是，NK 细胞可能会获得类似记忆的功能，从而更有效地应对第二次微生物感染，这类似于常见的T细胞介导记忆。

　　人NK 细胞起源于骨髓中的多能 HSC。根据经典的“线性”模型，NK 细胞发育通过多个步骤进行，每个步骤都以特定表面标志物的表达为特征，这些标志物定义了对淋巴/NK细胞谱系不同阶段。

　　•第一阶段：骨髓，CD34+CD45RA+ HSC•第二阶段：次级淋巴组织（扁桃体、淋巴结、脾脏），CD56、CD117 和 IL-1R1开始出现•第三阶段：次级淋巴组织（扁桃体、淋巴结、脾脏），CD34 缺失•第四阶段：次级淋巴组织（扁桃体、淋巴结、脾脏），CD94表达，CD117下调，对应着CD56bright NK 细胞。从这个阶段开始，NK 细胞表达高水平的转录因子 T-BET 和 EOMES。值得注意的是，第 4 阶段进一步细分为 4a 和 4b 阶段，后者的特征是 NKp80 表达和形成含有穿孔素和颗粒酶的细胞毒颗粒，获得细胞毒性能力。这些颗粒的胞吐作用发生在免疫突触处，使 NK 细胞能够将细胞溶解过程精确地靶向单个病变细胞，而不会影响其邻近细胞。•第五阶段：开始表达CD16 和 KIR（CD56dim NK）•第六阶段：开始表达CD57，标志着 NK 细胞的终末分化。

　　与成熟的 CD56dimCD16+ 亚群相比，CD56bright CD16– NK 细胞在外周血 (PB) 中的含量较少，细胞毒性较差，并且在暴露于环境因素后，会产生大量的 NK 细胞标志性细胞因子IFN-γ和 TNF-α。

　　体内 NK 细胞多样性的证据对这种“线性”发育模型提出了质疑，这表明，由于共同前体细胞的可塑性，环境因素可以改变 NK 细胞的发育途径。在这种情况下，现在人们认识到，当与支持 NK 的细胞因子一起培养时，NK 细胞不仅与淋系细胞分化，而且还与髓系前体细胞分化。这种可能性在从脐带血中分离的 CD34+ HSC 的体外培养实验和人源化小鼠的体内实验得到证实。此外，在骨髓中发现了具有NK 和T 细胞受限潜能的Lin-CD34+ DNAM1 bright CXCR4+ 祖细胞，在慢性炎症性疾病时，这类细胞在外周血显著增加，说明在抗病毒反应时，这些祖细胞是快速产生效应淋巴细胞的“捷径”，一步到位。事实上，由这种特殊祖细胞产生的 NK 细胞能够控制 CMV 感染并表现为成熟的 KIR+ NKG2C+ CD57+ 表型，该表型与CMV驱动NK细胞扩增的特征相似，有记忆功能，通常被称为作为“适应性 NK 细胞”。

　　随着与 NK 细胞相关的非细胞毒性「辅助ILC」的发现，现有的 NK 细胞发育模型需进行修改。在 SLT 中发现了类似于“第 3 阶段”NK 细胞前体并依赖于转录因子 RORγt 表达的祖细胞群，能够生成所有人类 ILC 亚群。在外周血中，存在一种ILC 前体 (ILCP) ，特征与先前在 SLT 中发现的前体相同。这种循环的 Lin-CD117+ 细胞群源自 CD34+ HSC，富含多能 ILCP，可产生包括 NK 细胞在内的所有 ILC 亚群。该类祖细胞一旦表达 CD56，后续可能走NK/ILC3 共同发育途径，而与ILC2分开。此外，由于NK 细胞和辅助 ILC 之间存在密切的发育关系，现已确定了 ILC 发育过程中表达的受体的新功能，如NKp46 是定义 ILC3 发育潜力的标志物，而 KLRG1和2B4表达说明倾向于分化为ILC2。

　　现在很明显，NK 细胞发育是一个“分支”型发育而不是“线性”过程，见下图。除了从骨髓开始并在稳定状态下 SLT 中进行的经典 NK 发育途径外，还存在其他途径，包括来自全身多能 ILCP 的所谓“ILC-poiesis”。哪些环境信号能够塑造这些分化轨迹，以及如何在组织和循环中产生适当的反应以及快速和在局部生成NK细胞，仍有待确定。

　　在与特定配体结合后，NK 细胞通过几种胚系编码的受体（Ig样家族I型蛋白或 C型凝集素样受体(CTLR)家族的II型蛋白）持续检查邻近细胞的健康状况。这些受体传递的活化和抑制信号之间的平衡精细地调节了 NK 细胞功能，见下图。

　　传递活化信号的关键是 ITAM 的磷酸化，更多地包含在其相关的适配蛋白中。受体跨膜结构域中带正电荷氨基酸的存在允许这种结合。相反，表现出抑制能力的受体显示出包含 ITIM 的长细胞质尾部，其酪氨酸磷酸化允许募集酪氨酸磷酸酶和转导抑制信号。一般而言，抑制性受体本身不发挥作用，而是调节活化受体传递的信号强度。

　　“开启”信号对于 NK 细胞杀死过度表达应激诱导配体的病变细胞至关重要，而且对于诱导它们与其他细胞类型的生理互也很重要。除了介导「抗体依赖性细胞介导的细胞毒性」 (ADCC) 的 CD16 (FcγRIIIA) 外，主要的活化受体是天然细胞毒性受体 (NCR) 和 NKG2D。NCR 包括 NKp46、NKp30 和 NKp44，均为Ig 样跨膜蛋白。NKp46 和 NKp30 几乎在所有静息 NK 细胞上表达，与 CD3-ζ 和/或 FcεRI-γ 相关，而 NKp44 在 NK 细胞活化后获得，通过 KARAP/DAP12 衔接分子发出信号。NCR 在 NK 细胞对各种肿瘤细胞类型的细胞毒性、与其他细胞的交互、调节固有和适应性免疫反应中均起主要作用。一个重要的例子是 NKp30 在介导“DC 编辑”的 NK/DC 相互作用中，有助于选择最适合的 DCs 进行抗原呈递和 DC 成熟。

　　虽然最初认为 NCR 表达仅限于 NK 细胞，但现在已知 NCRs 可以由 ILCs 表达；NKp44 和 NKp46 在 ILC3 亚群中的表达，与 IL-22 的产生有关，而 NCR–的ILC3 产生 IL-17。此外，特别是用IL-15扩增的人 γδ T 和 CD8+ T 细胞表达NKp30，从而获得“NK 样”抗肿瘤活性。最后，发现了不同的 NCR 同种型，其中一些能够传递具有免疫抑制作用的抑制性信号，并与癌症预后相关。

　　NK 细胞表面还有多种活化辅助受体，包括 DNAM-1、NKp80、2B4 和 NTB-A。PVR（CD155）和 Nectin-2（CD112）与DNAM-1 的结合，与NK杀伤各种肿瘤细胞和“不适合”的 DC相关，也是蜕膜 NK 和滋养层细胞之间相互作用的位点。在炎性细胞因子存在的情况下，NKp80-AICL 相互作用促进单核细胞和 NK 细胞之间的活化串扰，导致 IFN-γ 和 TNF-α 的分泌，也在 NK 介导的髓系白血病细胞监测中发挥作用。2B4 和 NTB-A 都属于信号淋巴细胞活化分子 (SLAM) 家族受体 (SFR)，并参与与造血细胞的相互作用。受体结合后，存在于细胞质尾部的免疫受体酪氨酸开关基序被磷酸化并与 SLAM 相关蛋白 (SAP) 结合，从而启动活化信号通路。在不存在 SAP 的情况下（如正常未成熟NK和蜕膜 NK 细胞， XLP1 患者的 NK 和 T 细胞（在编码 SAP 的 SH2D1A 中携带突变）），SFRs 与酪氨酸磷酸酶连接，从而传递抑制信号。XLP1中这种抑制功能与无法EBV感染的B细胞相关，对临床症状影响甚大。

　　在不同供体中可以检测到循环 NK 细胞库中高度多样化的受体库，这主要是由于KIR和HLA I 类基因型的高度多态性。值得注意的是，KIR 表达模式是随机事件的结果，但受自身 HLA I 类分子的影响很大。某些 NK 细胞具有同种异体反应性，是由 iKIR 的独特表达定义的。如今，先进的多参数流式细胞术和飞行时间技术的质谱流式细胞术能同时评估许多参数，揭示每个人超过 10E5 个表型不同的亚群。除遗传外，环境因素，尤其是病毒感染，也会影响 NK 细胞受体库。

　　值得注意的是，NKG2A 和 KIR 也可能由 T 淋巴细胞表达并损害其体外功能，正如最近 NKG2A 在人和小鼠的肿瘤浸润性T细胞联合疗法，包括阻断 NKG2A 或 KIR 免疫检查点 (IC) 的抗体，在临床试验中似乎很有效。

　　有趣的是，在巨噬细胞中存在TLR 和 miRNA 之间的双向调节。TLR 信号调节 miRNA 表达，而一些 miRNA 在与 TLR3 和 TLR7/8 结合后调节 TLR 表达/信号或诱导免疫和炎症基因表达。评估这些事件是否也发生在 NK 细胞中将会很有趣。

　　除了 TLR 之外，白细胞介素 1 受体 (ILR) 家族的成员也是固有免疫反应和炎症的关键参与者。与 TLR 类似，它们的特征是在其细胞质尾部存在 Toll/白细胞介素-1 受体 (TIR) 结构域。激动剂与 TLRs 或 ILRs 的胞外域的结合诱导它们的 TIR 域与参与活化蛋白激酶的接头多肽相连接，因此，与参与免疫反应的转录因子和基因相关。最近，IL-1R8（ILR 家族的一员）被认为是NK细胞的负调节因子，它的缺乏与不同组织中成熟 NK 细胞数量增加、活化 NK 受体的表达增加、IFN-γ、颗粒酶 B 含量和脱颗粒的产生增加有关。这些作用在 IL-18 耗竭后或在 IL-1R8/IL-18 双缺陷小鼠中消失，因此，证明 IL-1R8 调节 IL-18 的信号传导，IL-18 是一种与 NK 细胞活化相关的细胞因子。此外，此外，IL-1R8抑制了ILRs或TLRs与它们的配体接合后由TIR介导的信号传导所引起的NFkB和JNK的激活。有趣的是，TLR 信号的负调控代表了几种病原体采用的免疫逃避策略，在一些细菌感染中，含有 TIR 的蛋白质会干扰 TIR-TIR 关联，与 IL-1R8一样具有干扰TIR信号受体的能力。NK 细胞中的 IL-1R8 阻断已被提议作为一种新的治疗方法来释放 NK 细胞对抗实体瘤 ，还有一些 TLR 激动剂正在研究用于治疗实体瘤。

　　通过分支的发育途径，NK细胞从出生时的有限多样性状态逐渐进化到高度分化和多样化的表型，其特征是具有多种受体库和功能，从而实现“广谱多样性”，即受遗传因素和环境刺激（如病原体暴露）的影响。

　　病原体攻击所产生影响的最显著例子之一是 CMV 对 NK 细胞产生的深远影响。这种疱疹病毒通过在 NK 细胞受体库中诱导持久的印记以及增强的效应功能，表明固有淋巴细胞可以与适应性淋巴细胞共享一些记忆特性。所有固有免疫细胞不仅能够快速感知病原体或其产物并对其作出反应，而且还能提高它们对第二次接触相同病原体的反应能力。这种现象代表了所谓的“训练免疫”或固有免疫记忆，与表观遗传修饰有关，主要在单核细胞/巨噬细胞中进行研究。值得注意的是，训练有素的免疫力通常不是 Ag 特异性的，并且显示出有限的持久性。然而，CMV 对 NK 细胞的深度调节远远超出了训练有素的免疫反应。在 CMV 感染后，NK 细胞发生重大重构，导致表达 HLA-E 特异性活化受体 CD94/NKG2C 的 NK 细胞扩增并显示高度分化的表面特征，即自身 KIR+ NKG2A– LILRB1+ CD57+ Siglec7-。这种 CMV 驱动的 NK 细胞群被称为“适应性”，其特征是稳定的表观遗传修饰，可调节表面受体和信号转接蛋白的表达，从而调节 NK 细胞的反应性。

　　适应性 NK 细胞对 IL-12 和 IL-18 的反应较差，并以低水平表达 NCR NKp30 和 NKp46，与常规成熟 NK 细胞（非 CMV 印迹）不同。另一方面，尽管它们处于高度分化状态，但它们通过释放细胞因子（例如 IFN-γ 和 TNF-α）、细胞毒性分子和经历增殖对 NKG2C 触发做出非常有效的反应。此外，适应性 NK 细胞具有增强的 ADCC 能力，这至少部分是由于信号分子 FcεRI-γ 的（表观遗传控制的）下调表达，发生在 CMV+ 中检测到的适应性 NK 细胞的一致部分健康受试者。

　　通过 CD16 参与支持 Ab 介导的反应，适应性 NK 细胞还可以控制由除 CMV 以外的病毒引起的感染。在这种情况下，适应性 NK 细胞也可能有助于某些疫苗接种的保护作用，尽管它们高度分化的特征可能会限制它们对疫苗产品的反应。值得注意的是，Maucourant 等人最近描述了 COVID-19 患者中不同的 PB NK 细胞免疫类型，将强活化的适应性 NK 细胞的存在与严重疾病联系起来。此外，适应性NK细胞已被证明在慢性刺激下通过激活受体参与表达检查点受体，如LAG-3和PD-1。这种现象让人联想起T细胞反应，在某些情况下可能使适应性NK细胞功能低下。

　　有趣的是，这种特定 NK 细胞亚群的产生也可能依赖于特定前体的释放，这些前体在炎症条件下离开 BM 并快速分化为响应 CMV 的适应性 NKG2C+KIR+NK 细胞。这些替代分化轨迹是否有利于其他病原体特异性的特化 NK 细胞亚群的迅速出现尚不清楚，值得进一步研究。

　　总而言之，NK 细胞能够适应周围环境，在响应细胞因子、趋化因子和其他可溶性因子（如 PAMP 和/或受体参与）而发生表型和功能变化时，表现出高度的功能和发育可塑性， 正如病毒驱动的适应性 NK 细胞亚群的出现所明确证明的那样。

　　对个体供体的多个组织中的 NK 细胞进行了高维转录和表型分析。结果表明，血液、BM、脾脏和肺中的 NK 细胞主要是 CD56dimCD16+，并且与 NK 细胞主要是 CD56bright 的 LN、扁桃体和肠道相比，以更高的比例存在。此外，已在血液和组织中检测到多种 NK 发育和分化状态，其中 LN 包含最不成熟的亚群，而血液和肺包含成熟且分化程度更高的状态。NK 细胞维持、分化和功能调节的组织内在模式表明了一种解剖分区模型，其中淋巴组织和肠道代表前体和未成熟的 NK 细胞，而免疫监视和效应功能主要发生在血液中、脾脏和肺，对应的是活化和分化的 NK 细胞。

　　肝脏是另一个不断受到从肠道排出的外来抗原攻击的器官，NK 细胞也在该部位负责免疫监视。tr-NK 细胞在肝脏中的滞留由 CXCR6、CXCR3 和 CCR5 介导，它们与基质细胞释放的趋化因子相互作用。肝脏 tr-NK 细胞富含 CD56bright NK 细胞，其特征在于特殊的转录因子谱，包括 HOBIT、T-BET、高 EOMES 表达和 TIGIT+ CD69+ CXCR6+ CD49e– 表型。

　　总之，这些数据表明 NK 细胞对给定刺激的反应可能取决于在给定环境中同时传递的信号组合。对调节 NK 细胞反应的这些外在机制进行更深入的表征可能有助于设计与直接靶向 NK 细胞的治疗策略互补的治疗策略。例如，在抗肿瘤治疗的背景下，阻断负责下调 NK 细胞反应的 TME 成分可能进一步有助于释放其抗肿瘤功能。

　　HLA I 类特异性抑制性受体的突破性发现以及它们控制 NK 细胞活化和功能的机制，为免疫反应受一系列抑制性受体调节的基本概念铺平了道路。这些受体代表真正的检查点，控制单个细胞或更复杂的反应。这些知识，连同介导 NK 细胞活化的受体的发现，为癌症治疗的重大进展提供了线索。在这种情况下，KIR 依赖性供体 NK 细胞同种异体反应性已在半相合 HSC 移植 (HSCT) 中被用于治疗高危白血病患者。对肿瘤治疗更普遍的兴趣是使用 ICI。

　　值得注意的是，NK细胞可能在基于mAbs破坏PD-1/PD-L轴的治疗中发挥重要作用，特别是在失去HLA I类表达的肿瘤中，T淋巴细胞无法检测到，但更容易受到NK介导的攻击。利用 NK 细胞功能是目前肿瘤免疫治疗新方法中的一个主要问题，例如，正在进行的对NK前体多样性的研究，特别是能够快速产生成熟的 适应性 NK细胞的新型祖细胞，这些细胞同时有着强大的细胞溶解活性并保持增殖能力，可能提供新的重要线索。事实上，这些祖细胞离开BM和/或它们的增殖，为NK细胞的产生提供了一个良好的工具，不仅对CMV有效，而且还 训练 出病原体特异性杀伤能力和抗肿瘤能力。转染IL-15基因可以增强NK细胞的功能并延长其生存期。其他新方法是基于使用工程化的可溶性分子（称为BiKE、TriKE和Engagers），将活化受体和/或NK细胞上的CD16与癌细胞上的抗肿瘤基因连接起来。

　　一种特别有前景的方法是使用嵌合抗原受体 (CAR-NK) 基因修饰的 NK 细胞靶向肿瘤抗原。事实上，与 T 淋巴细胞不同，NK 细胞不会引起 GvHD。因此，来自无关供体的 CAR-NK 细胞代表了一种极好的“现成”产品 。经证实的培养和储存大量 NK 细胞的能力，可使用程序化的细胞数量对患者进行快速治疗，而无需转染个体患者的 T 细胞。尽管癌症患者体内产生的 TME 和/或抑制性细胞会极大地干扰大多数基于细胞的免疫治疗方法，但可以通过针对主要抑制机制的联合疗法（例如 ICI）来挽救抗肿瘤作用。总之，NK 细胞很可能在许多这些新型免疫治疗方法中提供一个重要的工具。